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Accurate identification and epidemiological characterization of Burkholderia cepacia complex: an update

Classification of Burkholderia cepacia complex

Basic taxonomy

Walter H. Burkholder は、1940 年代半ばにニューヨーク州でタマネギの腐敗を引き起こす植物病原性細菌を報告し、その種を「セパシア」と命名した。 これは当初Pseudomonas cepaciaとして知られていたが、後に1992年にBurkholderiales目、Burkholderiaceae科のBetaproteobacteria classに含まれ、Burkholderia cepaciaと呼ばれるようになった 。 Burkholderiaは、後にRalstonia属に分類されたPseudomonas pickettiiとPseudomonas solanacearumを除く、旧rRNAグループII偽陽菌(Pseudomonas gladioli、Pseudomonas mallei、Pseudomonas pseudomallei、Pseudomonas caryophylli)などを含んでいる 。 Burkholderia属は植物病原菌や土壌細菌として知られていたが、B. malleiとB. pseudomalleiはヒトや動物の病原菌である。

この属には現在22の有効な種が記載されている。 B. cepacia (タイプ), Burkholderia caryophylli, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Burkholderia gladioli, Burkholderia plantarii, Burkholderia glumae, Burkholderia vietnamiensis, Burkholderia andropogonis, Burkholderia multivorans, Burkholderia glathei.などの22の菌種が記載されています。 Burkholderia pyrrocinia, Burkholderia thailandensis, Burkholderia graminis, Burkholderia phenazinium, Burkholderia caribensis, Burkholderia kururiensis, Burkholderia ubonensis, Burkholderia caledonica, Burkholderia fungorum, Burkholderia stabilis 及び Burkholderia ambifaria 。

1990年代半ば以降、異なる生態系から分離されたB. cepacia株の間で異質性が指摘されるようになった。 このため、分離されたB. cepaciaの正確な同定に問題があり、使用された技術の評価では、感度が低い、特異性が低い、感度と特異性のいずれでもないことが示された。

さらに、Vandammeらは多相分類アプローチを評価し、CF患者や他のソースから推定したB. cepaciaは異なり、5つのジェノムバー(表現型的に類似するゲノム種)に属していることを示した。 当初、これら5つのゲノム種を総称してB. cepacia complex(Bcc)と呼んでいた。 その後、多相的な分類学的研究により、genomovar VIとB. ambifaria genomovar VIIが同定され、Bccに追加された。 さらに、B. pyrrociniaもBccに加えられた。

Ralstonia, Cupriavidus, Pandoraea, Achromobacter, Brevundimonas, Comamonas, Delftiaは、Burkholderiaと近縁な属として最も多く、Bccを正確に識別する上で問題となっている。 本稿では、これらの属を非Burkholderia属と呼ぶことにする。 同様に、Bccの正確な同定を妨げるBurkholderia属(B. humptydooensisおよびB. pseudomallei complex)をnon-Bccと呼ぶ。

Molecular phylogeny

これまで、B. cepacia complexの異なる種はDNA-DNA hybridization値が30~60%、同種の菌株は>70%を示していることが明らかになっている。 一方、BccでないBurkholderiaでは30%以下であった。 また、DNAの近縁性は、同種では高い(> 70%)、種レベルでは低いが有意である(30~60%)、有意でない(< 30%)と評価された。

Biochemical reactions

CF患者からB. cepacia complexを選択的に分離するため、長年にわたり様々な培地組成が使用されている。 これには、P. cepacia 培地 (PC 寒天) (300 U of polymyxin B/ml and 100 µg of ticarcilline/ml) ; Oxidation-fermentation agar with lactose and polymyxin B (OFPBL agar) (300 U of polymyxin B/ml and 0.1 U of polymyxin B) がある。2 U),およびB. cepacia selective agar(BCSA)(1% ラクトースおよび1% ショ糖,カゼインおよび酵母エキスの濃縮ベース,600 UのポリミキシンB/ml,10 μgのゲンタマイシン/mlおよび2.5 μgのバンコマイシン/ml)であった. BCSAは,CF呼吸器検体からB. cepacia complexを回収する際に,他菌の発育を抑制し,他の2つの方法よりも効果的であることが証明された. ただし,B. gladioliとRalstonia spp.は例外的にBCSAで生育可能であった。 B. cepacia complex, B. gladioli, Pandoraea spp., R. pickettii, A. xylosoxidans, S. maltophiliaの鑑別に用いた生化学的反応を表1に示す(

Table 1 B. cepacia complex, B. gladioli, Pandoraea spp, R. pickettii, A. xylosoxidans, and S. maltophilia

最近の開発により、病原体同定のための自動/市販の検査システムが発明されました。

Bcc in cystic fibrosis

発熱や呼吸不全を伴う劇症型肺炎、時に敗血症を伴う症例は「セパシア症候群」として知られている。 嚢胞性線維症患者における圧倒的なB. cepacia複合体感染症は、異常な数の研究と様々なデータを促している。 また、B. cepaciaは、消毒剤、ネブライザー液、洗口液、医療器具、脂質エマルジョンストッパーの汚染による点滴液の汚染による院内集団感染でも頻繁に遭遇していた。 しかし、米国、カナダ、イタリア、オーストラリアの報告では、CF患者では、非CF患者よりもB. multivoransとB. cenocepaciaが優勢であった。

Burkholderia sppの正確な同定の問題点

日常臨床検査室では、手動または自動の市販システムによる表現型検査がBcc同定に使用されている。 しかし、生化学的結果の類似性が高いため、種レベルの同定には至っていない。 Phoenix, VITEK 2, VITEK MS, Brukerなどの自動同定システムにより、Bcc, non-Bcc, non-Burkholderia spp.が異なる特異度で同定された(表2)

Table 2 Biochemical and molecular identification of Burkholderia cepacia complex in hospital acquired infections

MALDI-TOF MS による細菌同定の信頼性について最近大きな関心が集まっている。 これは、細菌細胞にレーザーを照射し、イオン化した細菌タンパク質(主にリボソームタンパク質)のスペクトル分析に基づくものである。 Fehlbergらは、Bcc臨床分離株の種同定におけるMALDI-TOF MSの性能を、recA配列決定と比較して評価しています。 MALDI-TOF MS の結果は、属レベルの同定 (n = 91) では recA シーケンスと 100% 一致しましたが、種レベルの同定では 76.9% (n = 70) の一致が認められました。 Gautamらによる別の研究では、Bccの同定について、MALDI-TOF MSと拡張MLSTおよびrecAシーケンシングを比較しています。 MALDI-TOF MSは属レベルで100%、種レベルで82%の一致率を示した。

臨床検体中のBurkholderia属と近縁のPandoraea, Cupriavidus, Ralstoniaの識別と区別の正確さは患者の治療にとって不可欠である。 この3つは、Burkholderia属以外で最も多く確認されている属です。 Pandoraea属は嚢胞性線維症(CF)患者と非CF患者の両方から報告されており、ほとんどの場合、表現型的にBccと誤認される。 P. pnomenusa, P. apista, P. pulmonicola, P. sputorumによるPandoraea菌血症は,従来の生化学的手法では同定が困難な症例が多く,本属菌の侵襲性の高さが理解される。

Ralstonia 属には R. pickettii と R. solanacearum (旧 Burkholderia pickettii と B. solanacearum), R. insidiosa, R. mannitolilytica があり、現在でも R. pickettii が主要病原種と見なされている。 R. pickettiiは、臨床的意義は低いと考えられているが、文献上では多くの感染例が報告されている。 R. pickettiiとBccの類似性が高いため、Bccの症例の多くがR. pickettiiと誤認された可能性がある。 R. pickettii感染症の原因として,注射用水,精製水による生理食塩水,無菌薬液などの汚染された溶液が多く挙げられている. R. pickettii感染症に関連する主な疾患は、菌血症・敗血症、呼吸器感染症・肺炎である。

RalstoniaとPandaroeaeをBccと誤同定することが非常に多い。 これらの属はBurkholderia属と非常に近縁で、標準的な生化学的手法では区別できないほどである。 Bcc (B. cepacia, B. multivorans, B. cenocepacia, B. vietnamiensis, B. stabilis, B. ambifaria, B. dolosa, B. anthina, B. pyrrocinia and B. ubonensis), B. humptydooensis, Cupriavidus spp.などが含まれる。 Pandoraea spp.およびB. pseudomallei。

Bccと非Burkholderia属菌は通常の生化学的方法では識別できなかった。 このような識別の問題から,Burkholderiaのクローン型別は疑問視されている. 16S rRNA,recA,hisA,rpsUなどの分子標的がBccの識別性を高めることが報告されている。 図1は、Bccを正確に同定するための様々な手法とその能力を示している。 1

figure1

Burkholderia 属レベル(近縁属)で正確に同定するための方法を描いたアルゴリズムです。 cepacia complex level (Bcc) and species level (within Bcc)

Need for molecular identification of Bcc

CF患者からの分離菌で、病原性が持続する場合は、その特徴ある表現型や増殖条件が失われ、Bccを正確に特定できないことがしばしばある。 そのため、Bccの分子生物学的同定が必要であり、Bcc内の種や近縁の属・種と区別する必要がある。 しかし、Bccと非Bccの識別を向上させるためには、複数の分子標的を用いることが不可欠である。 分子標的としては、hisA、rpsU、recA、16S rRNAなどが報告されている。 720>

hisA, rpsU遺伝子配列決定

ヒスチジンの生合成に関わる酵素をコードするhisA遺伝子の配列決定がBcc内の種を識別することが報告された. 134種のBcc生物についてNeighbour-joining法による解析を行った結果、同種の菌株間で高い配列類似性が認められた。 一方、それぞれの種は明確に分離されていた。 また、hisAを用いた解析では、17種のBccが高いブートストラップ値(> 75%)で異なるクラスター(B. cenocepaciaの4系統区分を含む)に分離された。 また、hisAに基づく解析に用いたBurkholderia株は、過去に多相分類法またはrecA配列決定法を用いて同定されたものである。 Frickmannらは、ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA), DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Germany), JCM (Japan Collection of Microorganisms, Tsukuba, Ibaraki Prefecture), BCCM/LMG (Bacteria Collection, Ghent, Belgium) およびNCTC (National Collection of Type Cultures, Porton Down, UK) の同一性が判明した菌株に対して、 rpsU シークエンス法による比較を実施し、Burkholdia の菌種を同定した。 また,recA配列の解析により同一性を確認した上で,比較のために少数の臨床株も解析に加えた。rpsU配列は,クラスターIにB. plantarii,B. glumae,B. cocovenenans,B. gladioli,クラスターIIにBurkholderia pseudomallei complex(B. mallei,B. pseudomallei,B. thailandensis),B. plantariiとglamaeを含む4クラスターを形成し,B. plantariiはB. caryophylli, B. multivorans, P. norimbergensis, B. ubonensis, B. stabilis, B. cenocepacia, B. cepacia, B. pyrrocinia, B. ambifaria, B. anthina, B. vietnamiensis および B. B. thailandensisがクラスターIIに含まれる。 dolosaがクラスターIIIに,B. sacchari,B. graminis,B. fungorum,B. phytofirmans,B. xenovorans,B. phenoliruptrix,B. phenazinium,B. caribensis,B. hospita,B. phymatumがクラスターIVに含まれる。 また,BurkholderiaとPandoreaのrpsU配列の相同性は>86%であった. Bccの臨床病原体の多くはrpsU配列のクラスタIIIに属し,B. caryophylli,B. multivorans,P. norimbergensisは同一配列を持ち,B. cenocepaciaはB. cepaciaとクラスタしていた. 720>

recA遺伝子シーケンス

recA もBurkholderia属の鑑別に有望なターゲットとしてよく知られている。 B. pseudomallei, B. mallei, B. thailandensis, B. humptydooensis, B. oklahomensis, B. malleiの19種のBurkholderiaを識別することができる。 oklahomensis, B. oklahomensis-like, B. ubonensis, B. ambifaria, B. multivorans, B. vietnamiensis, B. fungorum, B. glumae, B. cepacia, B. xenovorans, B. dolosa, B. gladioli および Bcc. しかし、非Burkholderia属はrecA配列決定では識別できない。 recAシークエンスの評価に使用したBurkholderia株は、全細胞タンパク質プロファイル解析と多相アプローチを用いて特性評価を行った

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