Site Overlay

Accurate identification and epidemiological characterization of Burkholderia cepacia complex: an update

Klasyfikacja Burkholderia cepacia complex

Podstawowa taksonomia

Walter H. Burkholder opisał fitopatogenną bakterię powodującą zgniliznę cebuli w stanie Nowy Jork w połowie lat 40. i nazwał gatunek „cepacia”. Początkowo była ona znana jako Pseudomonas cepacia, później w 1992 roku włączona do klasy Betaproteobacteria, z rzędem Burkholderiales i rodziną Burkholderiaceae jako Burkholderia cepacia . Burkholderia obejmuje dawne pseudomonady grupy II rRNA (Pseudomonas gladioli, Pseudomonas mallei, Pseudomonas pseudomallei i Pseudomonas caryophylli), z wyjątkiem Pseudomonas pickettii i Pseudomonas solanacearum, które później zostały zgrupowane w rodzaju Ralstonia . Gatunki Burkholderia były znane jako patogeny roślin i bakterie glebowe, z wyjątkiem B. mallei i B. pseudomallei, które są patogenami ludzi i zwierząt .

Rodzaj obejmuje obecnie 22 ważnie opisane gatunki: B. cepacia (gatunek typu), Burkholderia caryophylli, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Burkholderia gladioli, Burkholderia plantarii, Burkholderia glumae, Burkholderia vietnamiensis, Burkholderia andropogonis, Burkholderia multivorans, Burkholderia glathei, Burkholderia pyrrocinia, Burkholderia thailandensis, Burkholderia graminis, Burkholderia phenazinium, Burkholderia caribensis, Burkholderia kururiensis, Burkholderia ubonensis, Burkholderia caledonica, Burkholderia fungorum, Burkholderia stabilis, i Burkholderia ambifaria .

Od połowy lat 90-tych zauważono heterogenność wśród szczepów B. cepacia izolowanych z różnych nisz ekologicznych. Spowodowało to problemy z dokładną identyfikacją izolatów B. cepacia, a ocena stosowanych technik wykazała, że były one albo niezbyt czułe, niezbyt specyficzne, albo ani czułe, ani specyficzne .

Ponadto Vandamme i wsp. ocenili polifazowe podejście taksonomiczne, aby wykazać, że domniemane „B. cepacia” od pacjentów z mukowiscydozą i innych źródeł były różne i należały do pięciu odrębnych genomowarów (fenotypowo podobnych gatunków genomowych). Należą do nich: B. cepacia genomovar I, B. multivorans genomovar II, genomovar III, B. stabilis genomovar IV i B. vietnamiensis genomovar V. Początkowo te pięć gatunków genomowych określano wspólnym mianem kompleksu B. cepacia (Bcc). Późniejsze polifazowe badania taksonomiczne zidentyfikowały genomowar VI i genomowar VII B. ambifaria, które dołączyły do Bcc . Ponadto, B. pyrrocinia została dodana do Bcc .

Ralstonia, Cupriavidus, Pandoraea, Achromobacter, Brevundimonas, Comamonas i Delftia są najczęściej spotykanymi rodzajami blisko spokrewnionymi z Burkholderia i powodują problemy w dokładnej identyfikacji Bcc. W niniejszym rękopisie są one określane jako nie-Burkholderia spp. Podobnie, Burkholderia spp. (B. humptydooensis i B. pseudomallei complex), które przeszkadzają w prawidłowej identyfikacji Bcc są określane jako non-Bcc.

Fylogeneza molekularna

Poprzednio, różne gatunki w obrębie kompleksu B. cepacia wykazywały wartości hybrydyzacji DNA-DNA pomiędzy 30 a 60%, podczas gdy szczepy tego samego gatunku wykazywały wartości >70%. Natomiast wartości uzyskane dla Burkholderia non-Bcc były poniżej 30% . Pokrewieństwo DNA jest oceniane jako wysokie (> 70%) u szczepów tego samego gatunku, niskie (30-60%), ale istotne poniżej poziomu gatunku, oraz nieistotne (< 30%).

Coenye i wsp. , porównał sekwencje 16S rDNA B. cepacia complex i gatunków pokrewnych, gdzie, podobieństwo szczepów w obrębie B. cepacia complex były wyższe (> 97,7%) w porównaniu do innych gatunków Burkholderia (< 97,0%).

Reakcje biochemiczne

Różne składy podłoży były w użyciu przez lata w celu selektywnej izolacji B. cepacia complex z próbek pacjentów z mukowiscydozą. Należą do nich: P. cepacia medium (PC agar) (300 U polimyksyny B/ml i 100 µg tikarcyliny/ml); Oxidation-fermentation agar with lactose and polymyxin B (OFPBL agar) (300 U polymyksyny B/ml i 0.2 U bacytracyny/ml) oraz B. cepacia selective agar (BCSA) (1% laktozy i 1% sacharozy w podłożu wzbogaconym kazeiną i ekstraktem drożdżowym z 600 U polimyksyny B/ml, 10 µg gentamycyny/ml i 2,5 µg wankomycyny/ml). BCSA okazał się skuteczniejszy od dwóch pozostałych w odzyskiwaniu B. cepacia complex z próbek z dróg oddechowych CF poprzez hamowanie wzrostu innych organizmów. Wyjątkiem są B. gladioli i Ralstonia spp., które mogą rosnąć na BCSA. Po wyizolowaniu, kilka reakcji biochemicznych stosowanych do różnicowania B. cepacia complex, B. gladioli, Pandoraea spp., R. pickettii, A. xylosoxidans i S. maltophilia jest wymienionych w Tabeli 1.

Tabela 1 Charakterystyka biochemiczna do różnicowania B. cepacia complex, B. gladioli, Pandoraea spp, R. pickettii, A. xylosoxidans, i S. maltophilia

Ostatni rozwój doprowadził do wynalezienia zautomatyzowanych/komercyjnych systemów testowych do identyfikacji patogenów. Jednakże istnieje kilka doniesień dotyczących niezdolności tych komercyjnych systemów do identyfikacji lub różnicowania izolatów B. cepacia complex od innych Burkholderia spp.

Bcc w mukowiscydozie

Najczęściej przypadki z piorunującą infekcją płucną wraz z gorączką i niewydolnością oddechową, sporadycznie powiązane z posocznicą, znane są jako „zespół cepacia”. Nadmierne zakażenia B. cepacia complex u chorych na mukowiscydozę spowodowały niezwykłą liczbę badań i różnorodność danych. B. cepacia była również często spotykana w ogniskach zakażeń szpitalnych z powodu skażenia środków dezynfekcyjnych, roztworów do nebulizacji, płynów do płukania jamy ustnej, wyrobów medycznych i roztworów dożylnych z powodu skażenia zatyczek emulsji lipidowych. Chociaż, B. multivorans i B. cenocepacia były zgłaszane jako dominujące wśród pacjentów z CF niż u pacjentów bez CF, jak zgłoszono w Stanach Zjednoczonych, Kanadzie, Włoszech i Australii .

Problemy w dokładnej identyfikacji Burkholderia spp.

Testy fenotypowe albo ręczne albo zautomatyzowane systemy komercyjne były w użyciu do identyfikacji Bcc w rutynowych laboratoriach klinicznych. Jednak identyfikacja na poziomie gatunku nie jest możliwa ze względu na duże podobieństwo wyników biochemicznych pomiędzy gatunkami. Zautomatyzowane systemy identyfikacji, w tym Phoenix, VITEK 2, VITEK MS i Bruker identyfikują Bcc, non-Bcc i non-Burkholderia spp. z różną specyficznością (Tabela 2) .

Tabela 2 Biochemiczna i molekularna identyfikacja Burkholderia cepacia complex w zakażeniach szpitalnych

W ostatnich dniach wzrosło zainteresowanie wiarygodnością MALDI-TOF MS dla dokładnej identyfikacji bakterii. Opiera się ona na analizie spektralnej białek bakteryjnych, głównie rybosomalnych, zjonizowanych w wyniku napromieniowania komórki bakteryjnej laserem. Fehlberg i wsp. oceniali skuteczność MALDI-TOF MS w identyfikacji gatunkowej izolatów klinicznych Bcc w porównaniu z sekwencjonowaniem recA. Wyniki MALDI-TOF MS były w 100% zgodne z sekwencjonowaniem recA dla identyfikacji na poziomie rodzaju (n = 91), podczas gdy 76,9% (n = 70) zgodności zaobserwowano dla identyfikacji na poziomie gatunku. W innym badaniu Gautam i wsp. porównali MALDI-TOF MS z rozszerzonym MLST i sekwencjonowaniem recA dla identyfikacji Bcc. MALDI-TOF MS wykazał 100% zgodność dla identyfikacji rodzaju i 82% dla identyfikacji na poziomie gatunku.

Dokładność w identyfikacji i różnicowaniu Burkholderia spp. w próbkach klinicznych z bliskimi sąsiadami Pandoraea, Cupriavidus i Ralstonia jest niezbędna w leczeniu pacjentów. Są to trzy najbardziej rozpowszechnione rodzaje zidentyfikowane poza rodzajem Burkholderia. W większości przypadków są one fenotypowo błędnie identyfikowane jako Bcc.

Gatunki Pandoraea były opisywane zarówno u pacjentów z mukowiscydozą (CF) jak i u pacjentów bez CF. Potencjał inwazyjny tego rodzaju można zrozumieć dzięki różnym zgłoszonym przypadkom bakteriemii wywołanych przez P. pnomenusa, P. apista, P. pulmonicola i P. sputorum, w których identyfikacja stanowiła poważną przeszkodę przy zastosowaniu konwencjonalnych metod biochemicznych.

Rodzaj Ralstonia obejmuje R. pickettii i R. solanacearum (dawniej Burkholderia pickettii i B. solanacearum), R. insidiosa, i R. mannitolilytica, gdzie R. pickettii jest nadal uważany za główny gatunek patogenny. Chociaż R. pickettii jest uważany za gatunek o niewielkim znaczeniu klinicznym, w literaturze opisano wiele przypadków infekcji. Ze względu na duże podobieństwo między R. pickettii i Bcc, wiele przypadków Bcc mogło zostać błędnie zidentyfikowanych, które w rzeczywistości są R. pickettii. W wielu przypadkach za przyczynę zakażeń R. pickettii uznano zanieczyszczone roztwory, w tym wodę do wstrzykiwań, roztwory soli wykonane z oczyszczonej wody oraz sterylne roztwory leków. Główne choroby związane z zakażeniem R. pickettii to bakteriemia/pokarmowa i zakażenia układu oddechowego/zapalenie płuc .

Bardzo często Ralstonia i Pandaroeae są błędnie identyfikowane jako Bcc. Te rodzaje są bardzo blisko spokrewnione z Burkholderia spp., tak że nie można ich odróżnić za pomocą standardowej metody biochemicznej. Gatunki obejmują Bcc (B. cepacia, B. multivorans, B. cenocepacia, B. vietnamiensis, B. stabilis, B. ambifaria, B. dolosa, B. anthina, B. pyrrocinia i B. ubonensis), B. humptydooensis, Cupriavidus spp, Pandoraea spp. i B. pseudomallei.

Bcc i non-Burkholderia spp. nie mogły być rozróżnione przy użyciu konwencjonalnych metod biochemicznych. Ze względu na problemy z identyfikacją, klonalne typowanie Burkholderia jest wątpliwe. Stwierdzono, że cele molekularne takie jak 16S rRNA, recA, hisA i rpsU zwiększają możliwości rozróżniania Bcc. Reprezentacja różnych technik i ich zdolność do dokładnej identyfikacji Bcc jest przedstawiona na Rys. 1.

Fig. 1
figura1

Algorytm przedstawiający metody dokładnej identyfikacji Burkholderia na poziomie rodzaju (blisko sąsiadującego rodzaju), cepacia complex (Bcc) oraz na poziomie gatunku (w obrębie Bcc)

Potrzeba molekularnej identyfikacji Bcc

Isolaty pochodzące od pacjentów z mukowiscydozą z utrzymującą się kolonizacją patogenną często tracą swoje charakterystyczne fenotypy lub warunki wzrostu, co prowadzi do trudności w dokładnej identyfikacji Bcc. Aby przezwyciężyć ten problem, konieczna jest identyfikacja molekularna, która pozwoli na odróżnienie gatunków w obrębie Bcc oraz od pokrewnych rodzajów/gatunków. Chociaż cele molekularne do identyfikacji nie są wiarygodne, gdy są stosowane pojedynczo, podejście wielocechowe jest niezbędne do poprawy identyfikacji organizmów Bcc i innych niż Bcc. Niektóre z opisanych celów molekularnych to hisA, rpsU, recA i 16S rRNA. Zdolność rozróżniania na poziomie rodzaju/kompleksu/gatunku przy użyciu tych celów wymieniono w tabeli 2.

Sekwencjonowanie genów hisA i rpsU

Sekwencjonowanie genu hisA, kodującego enzym zaangażowany w biosyntezę histydyny, zostało zgłoszone w celu rozróżnienia gatunków w obrębie Bcc. Analiza metodą łączenia sąsiedzkiego 134 organizmów Bcc wykazała wysoki stopień podobieństwa sekwencji między szczepami tego samego gatunku. Jednocześnie każdy gatunek był wyraźnie od siebie oddzielony. Analiza oparta na hisA wyodrębniła 17 gatunków Bcc w różnych klastrach (w tym 4 linie podziału B. cenocepacia) z wysokimi wartościami bootstrap (> 75%). Szczepy Burkholderia użyte do analizy opartej na hisA zostały wcześniej zidentyfikowane przy użyciu taksonomii polifazowej lub sekwencjonowania recA .

Podobnie, rpsU zostało rozpoznane do identyfikacji różnych gatunków wśród rodzaju Burkholderia . Frickmann i wsp. zastosowali metodę sekwencjonowania rpsU do porównania szczepów Burkholderia o znanej tożsamości z ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA), DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Niemcy), JCM (Japan Collection of Microorganisms, Tsukuba, Ibaraki Prefecture, Japonia), BCCM/LMG (Bacteria Collection, Ghent, Belgia) i NCTC (National Collection of Type Cultures, Porton Down, UK). Sekwencje rpsU utworzyły cztery skupiska, w tym B. plantarii, B. glumae, B. cocovenenans i B. gladioli w skupisku I, kompleks Burkholderia pseudomallei (B. mallei, B. pseudomallei i B. thailandensis) w skupisku II, B. caryophylli, B. caryophylli, B. pseudomallei i B. thailandensis w skupisku II. caryophylli, B. multivorans, P. norimbergensis, B. ubonensis, B. stabilis, B. cenocepacia, B. cepacia, B. pyrrocinia, B. ambifaria, B. anthina, B. vietnamiensis i B. dolosa w skupisku III, a B. sacchari, B. graminis, B. fungorum, B. phytofirmans, B. xenovorans, B. phenoliruptrix, B. phenazinium, B. caribensis, B. hospita i B. phymatum w skupisku IV. B. glathei, B. caledonica i B. kururensis były obserwowane jako outliers.

Co więcej, homologia sekwencji rpsU dla Burkholderia i Pandorea wynosiła > 86%. Większość klinicznych patogenów Bcc należy do klastra III sekwencjonowania rpsU, gdzie B. caryophylli, B. multivorans i P. norimbergensis miały identyczne sekwencje, a B. cenocepacia grupowała się z B. cepacia. Ograniczeniem sekwencjonowania rpsU jest to, że nie może ono wiarygodnie dyskryminować Burkholderia spp. na poziomie gatunku jako pojedynczy cel.

sekwencjonowanie genu recA

recA jest kolejnym dobrze znanym celem obiecującym do różnicowania gatunków Burkholderia. recA może różnicować następujące 19 gatunków Burkholderia: B. pseudomallei, B. mallei, B. thailandensis, B. humptydooensis, B. oklahomensis, B. oklahomensis-like, B. oklahomensis-like, B. ubonensis, B. ambifaria, B. multivorans, B. vietnamiensis, B. fungorum, B. glumae, B. cepacia, B. xenovorans, B. dolosa, B. gladioli i Bcc . Jednakże, nie-Burkholderia spp. nie mogą być rozróżnione przez sekwencjonowanie recA. Szczepy Burkholderia używane do oceny sekwencjonowania recA zostały scharakteryzowane przy użyciu analizy profilu białek całej komórki i podejścia polifazowego .

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.