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Identificação precisa e caracterização epidemiológica do complexo Burkholderia cepacia: uma atualização

Classificação do complexo Burkholderia cepacia

Taxonomia básica

Walter H. Burkholder descreveu uma bactéria fitopatogênica causadora da podridão da cebola no estado de Nova York em meados dos anos 40 e nomeou a espécie ‘cepacia’ . Esta foi inicialmente conhecida como Pseudomonas cepacia, mais tarde em 1992 incluída na classe Betaproteobacteria, com ordem de Burkholderiales e família Burkholderiaceae como Burkholderia cepacia . Burkholderia inclui antigos pseudomonas rRNA grupo II (Pseudomonas gladioli, Pseudomonas mallei, Pseudomonas pseudomallei e Pseudomonas caryophylli), exceto Pseudomonas pickettii e Pseudomonas solanacearum, que mais tarde foram agrupadas sob o gênero Ralstonia . As espécies de Burkholderia eram conhecidas como patógenos vegetais e bactérias do solo, exceto B. mallei e B. pseudomallei, que são patógenos humanos e animais .

O gênero agora inclui 22 espécies validamente descritas: B. cepacia (as espécies do tipo), Burkholderia caryophylli, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Burkholderia gladioli, Burkholderia plantarii, Burkholderia glumae, Burkholderia vietnamiensis, Burkholderia andropogonis, Burkholderia multivorans, Burkholderia glathei, Burkholderia pyrrocinia, Burkholderia thailandensis, Burkholderia graminis, Burkholderia phenazinium, Burkholderia caribensis, Burkholderia kururiensis, Burkholderia ubonensis, Burkholderia caledonica, Burkholderia fungorum, Burkholderia stabilis e Burkholderia ambifaria .

Desde meados dos anos 90, notou-se heterogeneidade entre as cepas de B. cepacia isoladas de diferentes nichos ecológicos. Isso causou problemas na identificação precisa dos isolados de B. cepacia, e a avaliação das técnicas utilizadas mostrou que elas ou não eram muito sensíveis, nem muito específicas, ou nem sensíveis nem específicas .

Outros, Vandamme et al. avaliaram uma abordagem taxonômica polifásica para demonstrar que os supostos “B. cepacia” de pacientes com FC e outras fontes eram diferentes e pertenciam a cinco genomovares distintos (espécies genômicas fenotípicas semelhantes). Isto inclui, B. cepacia genomovar I, B. multivorans genomovar II, genomovar III, B. stabilis genomovar IV e B. vietnamiensis genomovar V. Inicialmente estas cinco espécies genômicas foram referidas coletivamente como o complexo B. cepacia (Bcc). Estudos taxonómicos polifásicos subsequentes identificaram genomovares VI e B. ambifaria genomovares VII que foram adicionados a Bcc . Além disso, B. pyrrocinia foi adicionado ao Bcc .

Ralstonia, Cupriavidus, Pandoraea, Achromobacter, Brevundimonas, Comamonas e Delftia são os gêneros mais comuns que estão intimamente relacionados ao Burkholderia e causam problemas na identificação precisa de Bcc. Estes são até agora referidos como não-Burkholderia spp. neste manuscrito. Da mesma forma, Burkholderia spp. (B. humptydooensis e complexo B. pseudomallei) que interfere na correta identificação de Bcc são referidas como não-Bcc.

Filogênese molecular

Anteriormente, diferentes espécies dentro do complexo B. cepacia mostraram ter valores de hibridização DNA-DNA entre 30 e 60%, enquanto estirpes da mesma espécie mostraram valores > 70%. Enquanto que, os valores obtidos com Burkholderia não-Bcc estavam abaixo de 30% . O DNA relacionado é classificado como alto (> 70%) em cepas da mesma espécie, baixo (30-60%), mas significativo abaixo do nível da espécie, e não significativo (< 30%).

Coenye et al. , comparou as 16 sequências de rDNA do complexo B. cepacia e espécies relacionadas, onde, as semelhanças das cepas dentro do complexo B. cepacia foram maiores (> 97,7%) em comparação com outras espécies de Burkholderia (< 97,0%).

Reações Bioquímicas

Diferentes composições de meios foram utilizadas durante anos para isolar seletivamente o complexo B. cepacia de amostras de pacientes com FC. Isto inclui, meio P. cepacia (ágar PC) (300 U de polimixina B/ml e 100 µg de ticarcilina/ml); ágar de oxidação-fermentação com lactose e polimixina B (ágar OFPBL) (300 U de polimixina B/ml e 0.2 U de bacitracina/ml) , e ágar selectivo B. cepacia (BCSA) (1% lactose e 1% sacarose numa base enriquecida de caseína e extracto de levedura com 600 U de polimixina B/ml, 10 µg de gentamicina/ml, e 2,5 µg de vancomicina/ml) . A BCSA foi comprovadamente eficaz do que os outros dois na recuperação do complexo B. cepacia a partir de amostras respiratórias CF, inibindo o crescimento de outros organismos . Embora, B. gladioli e Ralstonia spp. sejam exceções que poderiam crescer com BCSA. No isolamento, poucas reações bioquímicas usadas para diferenciar o complexo B. cepacia, B. gladioli, Pandoraea spp., R. pickettii, A. xylosoxidans, e S. maltophilia estão listadas no quadro 1.

Quadro 1 Características bioquímicas para diferenciar o complexo B. cepacia, B. gladioli, Pandoraea spp, R. pickettii, A. xylosoxidans, e S. maltophilia

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Recent developments had led to invention of automated/commercial test systems for pathogen identification. No entanto, há vários relatos referentes à incapacidade desses sistemas comerciais de identificar ou diferenciar os isolados do complexo B. cepacia de outros Burkholderia spp. .

Bcc em fibrose cística

A maioria das vezes, os casos com infecção pneumónica fulminante juntamente com febre e insuficiência respiratória, associação ocasional com septicemia, é conhecida como “síndrome de cepacia” . As esmagadoras infecções pelo complexo B. cepacia em pacientes com fibrose cística provocaram um número incomum de estudos e uma variedade de dados. B. cepacia também foi frequentemente encontrada em surtos nosocomiais devido a desinfetantes contaminados, soluções nebulizantes, lavagem bucal, dispositivos médicos e soluções intravenosas devido à contaminação de rolhas de emulsão lipídica . No entanto, B. multivorans e B. cenocepacia foram relatados como predominantes entre pacientes com FC do que pacientes sem FC, como relatado dos Estados Unidos, Canadá, Itália e Austrália .

Problemas na identificação precisa de Burkholderia spp.

Testes fenotípicos, tanto manuais quanto sistemas comerciais automatizados, foram utilizados para identificar Bcc em laboratórios clínicos de rotina. No entanto, a identificação ao nível das espécies não é alcançada devido à elevada semelhança de resultados bioquímicos entre as espécies. Sistemas automatizados de identificação incluindo Phoenix, VITEK 2, VITEK MS e Bruker identificam Bcc, non-Bcc e non-Burkholderia spp. em diferentes especificidades (Tabela 2) .

Quadro 2 Identificação bioquímica e molecular do complexo Burkholderia cepacia em infecções adquiridas em hospitais

Existe um interesse considerável nos últimos dias sobre a confiabilidade do MALDI-TOF MS para uma identificação bacteriana precisa. Baseia-se na análise espectral de proteínas bacterianas, principalmente proteínas ribossômicas, ionizadas pela irradiação a laser da célula bacteriana. Fehlberg et al. avaliaram o desempenho do MALDI-TOF MS para identificação de espécies de isolados clínicos de Bcc em comparação com o sequenciamento recA. Os resultados de MALDI-TOF MS estavam 100% em concordância com o sequenciamento recA para identificação do nível de gênero (n = 91), enquanto 76,9% (n = 70) concordância foi observada para identificação do nível de espécie. Outro estudo de Gautam et al. comparou o MALDI-TOF MS com um MLST expandido e sequenciamento recA para identificação de Bcc. MALDI-TOF MS mostrou concordância de 100% para a identificação do género e 82% para a identificação ao nível da espécie.

A precisão na identificação e diferenciação de Burkholderia spp. em amostras clínicas com os vizinhos próximos Pandoraea, Cupriavidus e Ralstonia é essencial para o tratamento dos doentes. Estes três são os géneros mais prevalecentes identificados fora do género Burkholderia. Na maioria das vezes estes são fenotípicamente mal identificados como Bcc.

Pandoraea espécies têm sido relatadas tanto de pacientes com fibrose cística (FC) como de pacientes não-CF. O potencial invasivo deste gênero pode ser compreendido através de vários casos relatados de Pandoraea bacteraemia causada por P. pnomenusa, P. apista, P. pulmonicola e P. sputorum , onde a identificação foi um grande revés quando métodos bioquímicos convencionais foram utilizados.

O gênero Ralstonia inclui R. pickettii e R. solanacearum (antiga Burkholderia pickettii e B. solanacearum), R. insidiosa, e R. manitolilytica, onde R. pickettii ainda é considerado como a principal espécie patogênica. Embora R. pickettii, é considerado de menor importância clínica, muitos casos de infecções são relatados na literatura. Devido à alta semelhança entre R. pickettii e Bcc, muitos dos casos de Bcc podem ter sido mal identificados, que na realidade são R. pickettii . Soluções contaminadas incluindo água para injeção, soluções salinas feitas com água purificada e soluções de drogas estéreis foram consideradas como a causa de infecções por R. pickettii em muitos dos casos. As principais condições associadas à infecção por R. pickettii são bacteremia/septicemia e infecções respiratórias/pneumonia .

Muitas vezes, Ralstonia e Pandaroeae são mal identificadas como Bcc. Estes géneros estão intimamente relacionados com Burkholderia spp., de tal forma que não podem ser distinguidos pelo método bioquímico padrão . As espécies incluem Bcc (B. cepacia, B. multivorans, B. cenocepacia, B. vietnamiensis, B. stabilis, B. ambifaria, B. dolosa, B. anthina, B. pyrrocinia e B. ubonensis), B. humptydooensis, Cupriavidus spp, Pandoraea spp., e B. pseudomallei.

Bcc e non-Burkholderia spp. não puderam ser distinguidas por métodos bioquímicos convencionais. Devido a problemas de identificação, a tipagem clonal de Burkholderia é questionável. Alvos moleculares como 16S rRNA, recA, hisA e rpsU foram relatados para aumentar a discriminação do Bcc. A representação de várias técnicas e sua capacidade de identificar com precisão o Bcc é dada na Fig. 1.

Fig. 1
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Algoritmo retratando os métodos para identificação precisa de Burkholderia a nível de gênero (próximo ao gênero vizinho), cepacia complex level (Bcc) and species level (within Bcc)

Need for molecular identification of Bcc

Isolados de pacientes com FC com colonização patogênica persistente frequentemente perdem seus fenótipos característicos ou condições de crescimento, o que leva a dificuldades na identificação precisa de Bcc. Para superar isso, a identificação molecular é necessária para distinguir espécies dentro do Bcc e do gênero/espécie relacionado. Embora os alvos moleculares para identificação não sejam confiáveis quando usados individualmente, uma abordagem multi-target é essencial para melhorar a identificação de organismos Bcc e não Bcc. Alguns dos alvos moleculares relatados são hisA, rpsU, recA e 16S rRNA. A capacidade discriminatória em nível de gênero/complexo/espécie usando esses alvos foram listados na Tabela 2.

seqüenciamento dos genes hisA e rpsU

Seqüenciamento do gene hisA, foram relatados códigos para uma enzima envolvida na biossíntese de histidina para distinguir espécies dentro do Bcc . A análise do método Neighbour-joining method analysis de 134 organismos Bcc revelou alto grau de similaridade de sequência entre estirpes da mesma espécie. Entretanto, cada espécie foi claramente separada uma da outra. A sua análise baseada em A separou 17 espécies de Bcc em diferentes grupos (incluindo 4 divisões de linhagem de B. cenocepacia) com altos valores de bootstrap (> 75%) . As cepas de Burkholderia usadas para a hisA análise foram previamente identificadas usando uma taxonomia polifásica ou uma sequência recA .

Similiarmente, a rpsU foi reconhecida para identificar diferentes espécies entre o gênero Burkholderia . Frickmann et al. utilizaram o método de sequenciamento rpsU para comparar as cepas de Burkholderia de identidade conhecida da ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, EUA), DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Alemanha), JCM (Japan Collection of Microorganisms, Tsukuba, Ibaraki Prefecture, Japão), BCCM/LMG (Bacteria Collection, Ghent, Bélgica), e NCTC (National Collection of Type Cultures, Porton Down, Reino Unido). Também poucas cepas clínicas foram incluídas na análise para comparação, depois de garantir sua identidade usando seqüenciamento recA. seqüências rpsU formaram quatro clusters incluindo B. plantarii, B. glumae, B. cocovenenans e B. gladioli no cluster I, o complexo Burkholderia pseudomallei (B. mallei, B. pseudomallei e B. thailandensis) no cluster II, B. caryophylli, B. multivorans, P. norimbergensis, B. ubonensis, B. stabilis, B. cenocepacia, B. cepacia, B. pyrrocinia, B. ambifaria, B. anthina, B. vietnamiensis e B. dolosa no grupo III, e B. sacchari, B. graminis, B. fungorum, B. phytofirmans, B. xenovorans, B. phenoliruptrix, B. phenazinium, B. caribensis, B. hospita e B. phymatum no grupo IV. B. glathei, B. caledonica e B. kururensis foram observados como outliers.

Além disso, a homologia da seqüência rpsU para Burkholderia e Pandorea foi > 86%. A maioria dos patógenos clínicos de Bcc pertence ao cluster III da seqüência rpsU, onde B. caryophylli, B. multivorans e P. norimbergensis tiveram seqüências idênticas e B. cenocepacia agrupada com B. cepacia. A limitação da sequenciação rpsU é que ela não poderia discriminar de maneira confiável Burkholderia spp. a nível de espécie como alvo único.

seqüenciação do gene recA

recA é outro alvo bem conhecido e promissor para a diferenciação das espécies de Burkholderia . recA pode diferenciar as seguintes 19 espécies de Burkholderia, a saber, B. pseudomallei, B. mallei, B. thailandensis, B. humptydooensis, B. oklahomensis, B. oklahomensis, B. ubonensis, B. ambifaria, B. multivorans, B. vietnamiensis, B. fungorum, B. glumae, B. cepacia, B. xenovorans, B. dolosa, B. gladioli e Bcc . No entanto, não-Burkholderia spp. não podem ser distinguidas por recA seqüenciamento. As cepas de Burkholderia usadas para avaliação da sequenciação recA foram caracterizadas usando a análise do perfil proteico de células inteiras e uma abordagem polifásica .

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