Site Overlay

Exakt identifiering och epidemiologisk karakterisering av Burkholderia cepacia complex: en uppdatering

Klassificering av Burkholderia cepacia complex

Grundläggande taxonomi

Walter H. Burkholder beskrev en fytopatogen bakterie som orsakar lökröta i New York State i mitten av 1940-talet och gav arten namnet ”cepacia” . Denna var ursprungligen känd som Pseudomonas cepacia, senare 1992 inkluderad i klassen Betaproteobacteria, med ordningen Burkholderiales och familjen Burkholderiaceae som Burkholderia cepacia . Burkholderia omfattar tidigare pseudomonader i rRNA-grupp II (Pseudomonas gladioli, Pseudomonas mallei, Pseudomonas pseudomallei och Pseudomonas caryophylli), med undantag för Pseudomonas pickettii och Pseudomonas solanacearum, som senare har grupperats under släktet Ralstonia . Burkholderia-arter var kända som växtpatogener och jordbakterier, utom B. mallei och B. pseudomallei, som är patogener för människor och djur .

Släktet omfattar nu 22 giltigt beskrivna arter: B. cepacia (typarten), Burkholderia caryophylli, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Burkholderia gladioli, Burkholderia plantarii, Burkholderia glumae, Burkholderia vietnamiensis, Burkholderia andropogonis, Burkholderia multivorans, Burkholderia glathei, Burkholderia pyrrocinia, Burkholderia thailandensis, Burkholderia graminis, Burkholderia phenazinium, Burkholderia caribensis, Burkholderia kururiensis, Burkholderia ubonensis, Burkholderia caledonica, Burkholderia fungorum, Burkholderia stabilis och Burkholderia ambifaria .

Sedan mitten av 1990-talet har heterogenitet noterats bland de B. cepacia-stammar som isolerats från olika ekologiska nischer. Detta orsakade problem med korrekt identifiering av B. cepacia-isolat, och utvärderingen av de använda teknikerna visade att de antingen inte var särskilt känsliga, inte särskilt specifika eller varken känsliga eller specifika .

Vidare utvärderade Vandamme et al. en polyfasisk taxonomisk metod för att visa att förmodade ”B. cepacia” från CF-patienter och andra källor var olika och tillhörde fem olika genomovarer (fenotypiskt likartade genomiska arter). Dessa omfattar B. cepacia genomovar I, B. multivorans genomovar II, genomovar III, B. stabilis genomovar IV och B. vietnamiensis genomovar V. Dessa fem genomiska arter kallades inledningsvis gemensamt för B. cepacia-komplexet (Bcc). I efterföljande polyfasiska taxonomiska studier identifierades genomovar VI och B. ambifaria genomovar VII som lades till Bcc . Dessutom lades B. pyrrocinia till i Bcc.

Ralstonia, Cupriavidus, Pandoraea, Achromobacter, Brevundimonas, Comamonas och Delftia är de vanligaste släktena som är nära besläktade med Burkholderia och som orsakar problem vid korrekt identifiering av Bcc. I detta manuskript kallas dessa hittills för icke-Burkholderia spp. På samma sätt kallas Burkholderia spp. (B. humptydooensis och B. pseudomallei-komplexet) som hindrar en korrekt identifiering av Bcc för icke-Bcc.

Molekylär fylogeni

Förut har olika arter inom B. cepacia-komplexet visat sig ha DNA-DNA-hybridiseringsvärden på mellan 30 och 60 %, medan stammar av samma art uppvisade värden på mellan > och 70 %. De värden som erhållits för Burkholderia som inte är Bcc var däremot lägre än 30 %. DNA-relationen bedöms som hög (> 70 %) hos stammar av samma art, låg (30-60 %) men signifikant under artnivån och icke-signifikant (< 30 %).

Coenye et al. har jämfört 16S rDNA-sekvenser från B. cepacia-komplexet och besläktade arter, där likheterna mellan stammar inom B. cepacia-komplexet och besläktade arter. cepacia complex var högre (> 97,7 %) jämfört med andra Burkholderia-arter (< 97,0 %).

Biokemiska reaktioner

I åratal har olika mediesammansättningar använts för att selektivt isolera B. cepacia complex från prover från CF-patienter. Detta inkluderar P. cepacia-medium (PC-agar) (300 U polymyxin B/ml och 100 µg ticarcillin/ml) ; Oxidations-fermenteringsagar med laktos och polymyxin B (OFPBL-agar) (300 U polymyxin B/ml och 0.2 U bacitracin/ml) och B. cepacia selektiv agar (BCSA) (1 % laktos och 1 % sackaros i en berikad bas av kasein och jästextrakt med 600 U polymyxin B/ml, 10 µg gentamicin/ml och 2,5 µg vankomycin/ml) . BCSA visade sig vara effektivare än de andra två när det gällde att återvinna B. cepacia-komplexet från respiratoriska prover från CF genom att hämma tillväxten av andra organismer . B. gladioli och Ralstonia spp. är dock undantag som kan växa på BCSA. Vid isolering används ett fåtal biokemiska reaktioner för att skilja B. cepacia complex, B. gladioli, Pandoraea spp., R. pickettii, A. xylosoxidans och S. maltophilia från varandra, se tabell 1.

Tabell 1 Biokemiska egenskaper för att skilja B. cepacia complex, B. gladioli, Pandoraea spp. från varandra, R. pickettii, A. xylosoxidans och S. maltophilia

Den senaste utvecklingen har lett till att man har uppfunnit automatiserade/kommersiella testsystem för identifiering av patogener. Det finns dock flera rapporter om att dessa kommersiella system inte kan identifiera eller särskilja isolat av B. cepacia-komplexet från andra Burkholderia spp..

Bcc vid cystisk fibros

För det mesta kallas fall med fulminerande lunginfektion tillsammans med feber och andningssvårigheter, ibland i samband med blodförgiftning, för ”cepacia-syndromet”. De överväldigande B. cepacia-komplexinfektionerna hos patienter med cystisk fibros har föranlett ett ovanligt stort antal studier och en mängd olika uppgifter. B. cepacia har också ofta påträffats i nosokomiala utbrott på grund av kontaminerade desinfektionsmedel, nebulisatorlösningar, munsköljmedel, medicintekniska produkter och intravenösa lösningar på grund av kontaminering av proppar för lipidemulsioner . B. multivorans och B. cenocepacia rapporterades dock vara vanligare bland CF-patienter än bland icke-CF-patienter enligt rapporter från USA, Kanada, Italien och Australien.

Problem vid korrekt identifiering av Burkholderia spp.

Fenotypiska tester, antingen manuella eller automatiserade kommersiella system, användes för att identifiera Bcc i kliniska rutinlaboratorier. Identifiering på artnivå är dock inte möjlig på grund av att de biokemiska resultaten är mycket likartade mellan arterna. Automatiserade identifieringssystem som Phoenix, VITEK 2, VITEK MS och Bruker identifierar Bcc, icke-Bcc och icke-Burkholderia spp. med olika specificitet (tabell 2).

Tabell 2 Biokemisk och molekylär identifiering av Burkholderia cepacia-komplexet i sjukhusförvärvade infektioner

Det finns ett stort intresse för MALDI-TOF MS:s tillförlitlighet för korrekt bakterieidentifiering. Den bygger på spektralanalys av bakterieproteiner, främst ribosomala proteiner, som joniseras genom laserbestrålning av bakteriecellen. Fehlberg et al. har utvärderat MALDI-TOF MS:s prestanda för artidentifiering av kliniska Bcc-isolat i jämförelse med recA-sekvensering. MALDI-TOF MS-resultaten överensstämde till 100 % med recA-sekvensering för identifiering på genusnivå (n = 91), medan 76,9 % (n = 70) överensstämning sågs för identifiering på artnivå. I en annan studie av Gautam et al. jämfördes MALDI-TOF MS med en utökad MLST och recA-sekvensering för identifiering av Bcc. MALDI-TOF MS uppvisade 100 % överensstämmelse för genusidentifiering och 82 % för identifiering på artnivå.

Den noggranna identifieringen och differentieringen av Burkholderia spp. i kliniska prover med de nära grannarna Pandoraea, Cupriavidus och Ralstonia är avgörande för behandlingen av patienter. Dessa tre är de vanligaste släktena som identifierats utanför Burkholderia-släktet. Oftast är dessa fenotypiskt felidentifierade som Bcc.

Pandoraea-arter har rapporterats från både patienter med och utan cystisk fibros (CF). Den invasiva potentialen hos detta släkte kan förstås genom olika rapporterade fall av Pandoraea-bakteriemi orsakad av P. pnomenusa, P. apista, P. pulmonicola och P. sputorum , där identifieringen var ett stort bakslag när konventionella biokemiska metoder användes.

Släktet Ralstonia omfattar R. pickettii och R. solanacearum (tidigare Burkholderia pickettii och B. solanacearum), R. insidiosa och R. mannitolilytica, där R. pickettii fortfarande anses vara den viktigaste patogena arten . Även om R. pickettii anses ha liten klinisk betydelse rapporteras många fall av infektioner i litteraturen. På grund av den stora likheten mellan R. pickettii och Bcc kan många av Bcc-fallen ha blivit felidentifierade och är i själva verket R. pickettii . Kontaminerade lösningar, inklusive injektionsvatten, saltlösningar tillverkade med renat vatten och sterila läkemedelslösningar, ansågs vara orsaken till R. pickettii-infektioner i många av fallen. De vanligaste sjukdomstillstånden i samband med R. pickettii-infektioner är bakteriemi/septikemi och luftvägsinfektioner/pneumoni.

Väldigt ofta felidentifieras Ralstonia och Pandaroeae som Bcc. Dessa släkten är mycket nära besläktade med Burkholderia spp. så att de inte kan särskiljas med biokemiska standardmetoder . Till arterna hör Bcc (B. cepacia, B. multivorans, B. cenocepacia, B. vietnamiensis, B. stabilis, B. ambifaria, B. dolosa, B. anthina, B. pyrrocinia och B. ubonensis), B. humptydooensis, Cupriavidus spp, Pandoraea spp. och B. pseudomallei.

Bcc och icke-Burkholderia spp. kunde inte särskiljas med konventionella biokemiska metoder. På grund av problemet med identifiering är klontypning av Burkholderia tveksam. Molekylära mål som 16S rRNA, recA, hisA och rpsU rapporterades öka diskrimineringen av Bcc. I figur 1 visas olika tekniker och deras förmåga att korrekt identifiera Bcc.

Figur 1. 1
Figur1

Algoritm som visar metoderna för noggrann identifiering av Burkholderia på genusnivå (närliggande genus), cepacia-komplexnivå (Bcc) och artnivå (inom Bcc)

Behov av molekylär identifiering av Bcc

Isolat från CF-patienter med ihållande patogen kolonisation förlorar ofta sina karakteristiska fenotyper eller tillväxtbetingelser, vilket leder till svårigheter med exakt identifiering av Bcc. För att övervinna detta krävs molekylär identifiering för att särskilja arter inom Bcc och från besläktade genus/arter. Även om molekylära mål för identifiering inte är tillförlitliga när de används var för sig, är det viktigt med en strategi med flera mål för att förbättra identifieringen av Bcc-organismer och organismer som inte är Bcc-organismer. Några av de rapporterade molekylära målen är hisA, rpsU, recA och 16S rRNA. Diskrimineringsförmågan på genus-/komplex-/artnivå med hjälp av dessa mål anges i tabell 2.

Sekvensering av hisA- och rpsU-generna

Sekvensering av hisA-genen, som kodar för ett enzym som är involverat i histidinbiosyntesen, rapporterades för att särskilja arter inom Bcc . En analys av 134 Bcc-organismer med hjälp av Neighbour-joining-metoden avslöjade en hög grad av sekvenslikhet mellan stammar av samma arter. Samtidigt var varje art tydligt åtskild från varandra. Den hisA-baserade analysen separerade 17 Bcc-arter i olika kluster (inklusive 4 linjer av B. cenocepacia) med höga bootstrap-värden (> 75 %). Burkholderia-stammar som användes för hisA-baserad analys identifierades tidigare med hjälp av en polyfasisk taxonomi eller recA-sekvensering .

På samma sätt identifierades rpsU för att identifiera olika arter inom Burkholderia-släktet . Frickmann et al. har använt rpsU-sekvenseringsmetoden för att jämföra Burkholderia-stammar med känd identitet från ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA), DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Tyskland), JCM (Japan Collection of Microorganisms, Tsukuba, Ibaraki Prefecture, Japan), BCCM/LMG (Bacteria Collection, Ghent, Belgien) och NCTC (National Collection of Type Cultures, Porton Down, Storbritannien). Även ett fåtal kliniska stammar ingick i analysen för jämförelse, efter att deras identitet hade säkerställts med hjälp av recA-sekvensering. rpsU-sekvenserna bildade fyra kluster, däribland B. plantarii, B. glumae, B. cocovenenans och B. gladioli i kluster I, Burkholderia pseudomallei-komplexet (B. mallei, B. pseudomallei och B. thailandensis) i kluster II, B. caryophylli, B. multivorans, P. norimbergensis, B. ubonensis, B. stabilis, B. cenocepacia, B. cepacia, B. pyrrocinia, B. ambifaria, B. anthina, B. vietnamiensis och B. dolosa i kluster III och B. sacchari, B. graminis, B. fungorum, B. phytofirmans, B. xenovorans, B. phenoliruptrix, B. phenazinium, B. caribensis, B. hospita och B. phymatum i kluster IV. B. glathei, B. caledonica och B. kururensis observerades som outliers.

För övrigt var rpsU-sekvenshomologin för Burkholderia och Pandorea > 86 %. De flesta av de kliniska patogenerna i Bcc tillhör kluster III av rpsU-sekvensering, där B. caryophylli, B. multivorans och P. norimbergensis hade identiska sekvenser och B. cenocepacia klustrade med B. cepacia. Begränsningen med rpsU-sekvensering är att den inte på ett tillförlitligt sätt kan särskilja Burkholderia spp. på artnivå som enskilt mål.

RecA-gensekvensering

recA är ett annat välkänt mål som är lovande för differentiering av Burkholderia-arter . recA kan särskilja följande 19 arter av Burkholderia, nämligen B. pseudomallei, B. mallei, B. thailandensis, B. humptydooensis, B. oklahomensis, B. oklahomensis, B. oklahomensis-like, B. ubonensis, B. ambifaria, B. multivorans, B. vietnamiensis, B. fungorum, B. glumae, B. cepacia, B. xenovorans, B. dolosa, B. gladioli och Bcc . Icke-Burkholderia spp. kan dock inte särskiljas genom sekvensering av recA. Burkholderia-stammar som användes för utvärdering av recA-sekvensering karakteriserades med hjälp av analys av helcellsproteinprofiler och ett polyfasiskt tillvägagångssätt.

Lämna ett svar

Din e-postadress kommer inte publiceras.